SP94：噬菌体展示筛出来的肝癌归巢肽

SP94 的发现可追溯到 2008 年。Lo 等人以肝癌细胞系为靶标，用噬菌体展示筛出特异结合肝癌细胞的噬菌体克隆 PC94，从中推导出合成肽 SP94，序列 SFSIIHTPILPL（12 肽）[1]。

筛选数据相当扎实。PC94 在 SCID 小鼠肝癌移植瘤模型中特异性归巢至肿瘤组织，不结合正常内脏器官；免疫组化进一步确认它识别肝癌患者手术标本中的肿瘤组织而不识别非肿瘤组织，阳性率 61.3%（19/31）[1]。

靶点在 2019 年被明确。Jiang 等人通过免疫沉淀和质谱分析，确认 GRP78（葡萄糖调节蛋白 78，又称 BiP/HSPA5）是 SP94 的膜受体[2]。GRP78 本是内质网分子伴侣，却在肝癌细胞表面高表达（csGRP78），正常细胞表面几乎不表达。选择性就来自这个分布差异本身。

它和 RGD、iRGD 那种作用于肿瘤微环境的靶向肽不是一类东西。SP94 直接打肝癌细胞表面的 GRP78，是细胞特异性靶向，不是泛肿瘤靶向。

图注：SP94 结合肝癌细胞表面高表达的 GRP78 实现主动靶向；ICG 提供近红外荧光读出与光热转化，光热治疗目前处于研究阶段。

递送能力也已被验证。Lo 等人把 SP94 偶联到脂质体阿霉素上，通过增强凋亡、减少血管生成提升疗效[1]。Zhang 等人构建 SP94 修饰的聚合物胶束，在 SMMC-7721 肝癌原位模型中肿瘤沉积达 14.9% ID/g，肿瘤/正常肝比约 6.9[3]。换个说法：每克肿瘤组织里能检出相当于给药量 15% 的药物，而同样时间点正常肝里的浓度只有它的七分之一。对靠肝毒性卡剂量的化疗药，这就是治疗窗口。

ICG：少数已获临床批准的近红外染料

ICG（吲哚菁绿）是七甲川花菁染料，分子式 C₄₃H₄₇N₂NaO₆S₂，分子量约 775。水溶液单体状态下激发约 780 nm、发射约 800-840 nm（不同体系报道有差异），处于近红外一区（NIR-I，750-900 nm），组织穿透 5-10 mm，自发荧光干扰极低。

它最独特的能力是成像与光热一体。近红外光照射下，既发射荧光用于成像，也把吸收的光能转成热。据文献报道，Huh-7 肝癌移植瘤模型中 823 nm 激光照射 3 分钟后肿瘤局部升温至约 48.5°C，同时检测到活性氧（ROS）产生，通过氧化应激诱导细胞凋亡[4]。这组条件是细胞与移植瘤层面的实验设置，人体剂量与安全性尚未确立，不能照搬。

需要澄清一个容易混的地方，ICG 获批的适应症是肝功能检测、眼底血管造影、淋巴与胆道示踪等诊断用途，光热治疗仍处研究阶段，不是任何监管机构批准的适应症。血浆蛋白结合率约 98%，主要由肝脏代谢经胆汁排泄。这个临床合规背景，让它在转化研究中比多数近红外染料更容易往前走一步。

表里的穿透深度这一列，是这三种染料在应用上真正的分水岭。可见光区的光子走不出 1 mm，浅层细胞培养和小动物皮下瘤还能用，一旦进到深部实体瘤或人身上，信号在到达探测器前就被组织吸收和散射掉了。近红外窗口的 5-10 mm 不是数量级的跃升，但它是"能不能做"和"能做多深"的区别。

图注：激发波长每往近红外推进，组织穿透深度提升、自发荧光干扰下降；三者中仅 ICG 兼具光热转化能力。

单点定量：序列化学与 ICG 偶联的天选匹配

ICG-NHS 酯（disulfo-ICG-NHS）是 ICG 与肽偶联的常用路线。NHS 酯与一级胺（-NH₂）反应形成稳定酰胺键，条件温和、产率高。但它不区分氨基来源，会与肽链上所有游离的一级胺反应，包括 N 端 α-氨基和 Lys 侧链的 ε-氨基。序列里含多个 Lys，就会得到多位点标记的混合物，标记率无法固定。

SP94 恰好规避了这个问题。拆开序列 SFSIIHTPILPL 看组成：S×2、F×1、I×3、H×1、T×1、P×2、L×2。无 Lys（K），不含 ε-氨基；无 Cys（C），不含巯基；无 Arg（R），不含胍基。唯一的一级胺是 N 端 Ser 的 α-氨基，所以 ICG-NHS 酯与它反应只有 N 端一个位点可标，产物只有一种，标记率天然为 1。

这个"1"的分量比听起来重：批次间一致性高，荧光信号与肽摩尔比固定，定量实验可重复；产物单一，不必分离异构体；信号强度直接对应肽浓度，不需要校正标记率差异。

图注：SP94 序列无 Lys 无 Cys，N 端唯一氨基，ICG-NHS 标记率天然为 1；iRGD 含 1 个 Lys 产生 2 种标记产物，cRGD 环肽标记位点不唯一。

iRGD 含 1 个 Lys，标记产生 N 端和 Lys 侧链两种产物，需要分离才能拿到单一标记物；cRGD 的环肽中 Lys 侧链同样参与反应，位点不唯一。SP94 的"零 Lys"序列省掉了这一步，在规模化制备和定量实验里是实打实的优势。

还有个容易踩的坑：SP94 存在序列变体。裸肽 SFSIIHTPILPL（12 肽）适合 ICG-NHS 直接标 N 端；部分文献和产品用 SFSIIHTPILPLGGC（14 肽，C 端加 GGC 尾），引入 Cys 走巯基-马来酰亚胺路线[3]。两种序列对应不同偶联化学，下单前必须明确，混用会直接导致标记策略失效。

从裸肽到脂质体锚定：六种策略怎么选

SP94 的价值远不止裸肽标记。按场景不同，它可以挂到 PEG 间隔臂、磷脂锚或荧光染料上，形成功能各异的产品。看这张表之前，先回答三个递进的问题，选型基本就定了：

体外还是体内？要荧光示踪吗？要脂质体锚定吗？

对照这三个问题，答案就出来了。体外验证选 DSPE-PEG-FITC-SP94；体内成像选裸肽加 ICG 标记；靶向载体选 DSPE-PEG-SP94 或 DOPE-PEG-SP94，再按是否需要内涵体逃逸定锚定脂质。

表里剩下两个点值得单独说。

DSPE 和 DOPE 的差别不在"哪个更好"，而在要解决什么问题。DSPE 是 C18 饱和链，嵌入膜深度大、解离速率低，适合需要稳定表面展示的载体；DOPE 是不饱和锚，呈锥形构型，在内涵体酸性环境中易形成六方相，促膜融合与 cargo 胞内释放。要稳定选 DSPE，要逃逸选 DOPE。

SH-PEG-SP94 的价值在"定点"，PEG 间隔臂增加柔性，减少标记基团对肽结合构象的干扰。SP94-COOH 走另一条路，C 端羧基经 EDC/NHS 活化后与氨基偶联，灵活度高但需自建反应体系。

从 FITC 到 ICG：波长选择的三个层级

标记波长不是随便选的，每往近红外推进一步，对染料的要求就严格一层。

体外实验 FITC 够用。激发约 494 nm、发射约 521 nm，适配常规荧光显微镜和流式，适合验证特异性结合、观察载体摄取。但它穿透不足 1 mm，自发荧光干扰大，做不了活体成像。

体内成像与术中导航只能上 ICG。约 780 nm 激发处在近红外一区，穿透 5-10 mm，自发荧光极低，对肝癌这类深部实体瘤是刚需。ICG 在激光照射下产热，使 ICG-SP94 不只做示踪，还能探索成像引导的光热治疗。

一个容易忽略的细节：ICG 疏水性比 FITC 强，偶联后肽的溶解性和聚集行为可能变化，浓度较高时易形成 H 聚集体，导致荧光淬灭和吸收峰位移。所以标记建议在 DMSO 或 DMF 体系中控制浓度完成，标记后透析或 HPLC 纯化去除游离 ICG。

常见问题

参考文献

[1] Lo A, Lin CT, Wu HC. Hepatocellular carcinoma cell-specific peptide ligand for targeted drug delivery. Mol Cancer Ther. 2008;7(3):579-589. PMID: 18347144.

[2] Jiang B, et al. GRP78-targeted ferritin nanocaged ultra-high dose of doxorubicin for hepatocellular carcinoma therapy. Theranostics. 2019;9(8):2167-2182. PMID: 31149036.

[3] Zhang J, et al. SP94 peptide mediating highly specific and efficacious delivery of polymersomal doxorubicin hydrochloride to hepatocellular carcinoma in vivo. Colloids Surf B Biointerfaces. 2021;197:111399. PMID: 33075660.

[4] Shirata C, Kaneko J, Inagaki Y, et al. Near-infrared photothermal/photodynamic therapy with indocyanine green induces apoptosis of hepatocellular carcinoma cells through oxidative stress. Sci Rep. 2017;7:13958. DOI: 10.1038/s41598-017-14401-0.